Evoluce viru ve zkumavce aneb o tom, co by teroristé neměli číst
Evoluci viru lze realizovat velmi snadno. Poznatky lze využít v genové terapii, nebo k tvorbě biologické zbraně. Záleží jen na tom kdo a s jakým cílem ji provede.
Zvětšit obrázek
Adenoasociované viry jak je vidíme v elektronovém mikroskopu. Převzato z http://www.ufbi.ufl.edu/facilities/msg/res-aav.html
Adeno-asociované viry (AAV) jsou jednovláknové DNA částice obalené proteinovou kapsidou, které se normálně replikují za pomoci jiných virů (helper viry- např. adenovirus, herpesvirus). Otázka jejich patogenity je sporná, avšak pro všeobecný nedostatek důkazů jsou považovány za neškodné a podle různých zdrojů je jimi v součastnosti nakaženo 70 – 90 % světové lidské populace.
Tyto viry jsou v poslední době ve středu zájmů vědců zabývajících se genovou terapií, kteří je hodlají využít jako možné vektory pro přenášení genetické informace. AAV se během svého životního cyklu zabudovávají do lidské DNA a tudíž by do ní mohli vkládat i informaci vytvořenou člověkem.
Imunitní systém člověka, tyto viry dosti úspěšně neutralizuje, čímž zabraňuje i možné genové terapii. David Schaffer, docent na UC Berkely, se spolu se svými kolegy rozhodli tento virus vylepšit. V podstatě šlo o to dosáhnout toho, aby se virus lépe množil a naše tělo se proti němu nedokázalo účinně bránit.
Použili k tomu nástroj hodný samotné matky přírody – evoluci. Přesněji řečeno urychlenou evoluci v laboratorních podmínkách.Do této doby byla takzvaná řízená evoluce využívána hlavně ke zvýšení aktivity enzymů, nebo k tvorbě účinnějších protilátek proti specifickému antigenu. Ve virové říši se dosud nepoužívala.
Zvětšit obrázek
David Schaffer
AAV obsahují ve svém obalu dva strukturní geny. Jeden řídí replikaci a integraci do hostitelského genomu a druhý tvorbu virového pláště. Proteiny, které tvoří plášť viru (kapsidu) jsou struktury, které náš imunitní systém rozeznává a bojuje proti nim svými protilátkami. Proto se výzkumníci zaměřili právě na ně, přesněji na gen, který odpovídá za jejich tvorbu.
Nejprve šlo o to získat dostatečnou genetickou variabilitu viru aby jej pak mohli podrobit selekci. K tomu vědci použili techniku, která umožňuje při kopírování genetického kódu vznik chyb.
Pro tuto techniku se používá anglický termín „error-prone PCR“ (česky něco jako k chybám náchylná polymerázová řetězová reakce). Při této reakci kopie vznikající nukleové kyseliny nejsou zcela identické s předlohou.
Tím se stává, že v některých místech genu vzniklé kopie kódují odlišné aminokyseliny. Zmíněnou techniku umožňující vznik chyb aplikovali na gen kódující plášťový protein.
To znamená, že izolovali z virové nukleové kyseliny tento gen a pak jej podrobili výše zmíněné technice „chybové replikace“. Tímto způsobem vědci získali mnoho variant jednoho genu, který později ovlivní podobu pláště viru.
Zvětšit obrázek
Model AAV. Na povrchu virového pláště jsou barevně znázorněny receptory, které jsou potenciálním cílem protilátek imunitního systému. Některé ze změn v těchto receptorech učinily, že se viry staly pro obranný systém „neviditelnými“. (David Schaffer/ UC Berkeley)
A na tuto metodu pak navazovala rekombinace DNA in vitro, kdy pozměněné řetězce byly vneseny pomocí enzymů do virové DNA.
Vektorová (virová) DNA je v určitém místě rozštěpena enzymem restrikční endonukleázou a cizí, nebo v tomto případě pozměněná část řetězce se do ní uzavře pomocí jiného enzymu ligázy tak, že vznikne nová rekombinantní molekula DNA. Ta pak za přítomnosti aminokyselin a nezbytných enzymů řídí celou stavbu virové částice.
Když měli vědci k dispozici sadu nově připravených virů, přidali k nim krevní sérum z králíků, kteří se již setkali s divokým typem viru a v jejichž krvi proti němu kolovaly protilátky. Protilátky způsobily to, že přežily jen ty nejsilnější, nejlépe přizpůsobené (mutované) viry.
Roli v tom hrál pouze přírodní výběr, neboť mutací vznikly náhodné změny – tedy jak ty výhodné pro přežití v prostředí protilátek, tak i ty s nevýhodnými změnami, které účinek protilátek vyřadil.
To, které přežily záviselo na schopnosti nově vyvinutých forem vyhnout se vazbě s protilátkou.
Viry jsou fascinující. Láska k nim je ale většinou nepřímo úměrná naší aktuální tělesné teplotě…
Přežívající viry vědci izolovali a znovu na nich nechali „vyřádit“ chybující metodu množení, aby dosáhli ještě většího počtu mutací. Postup se opakoval a při každém selektivním výběru zvyšovali dávku protilátek. Tím se stalo, že nevýhodné mutace „odpadly“ a zůstali AAV „superviry“.
Darwin by zaplesal. Takto dvakrát pozměněný virus přežil v pokusných myších tisící násobek dávky protilátek Ne to není překlep, k eliminaci těchto virů bylo třeba dodat myši 1000x více protilátek, než kolik jich stačilo k ochraně před divokým typem viru.
Tým Berkeleyské univerzity toto vše zvládl za 2 měsíce.
Ve zmutovaných virech, které se podařilo v tomto pokusu vyrobit, bylo zjištěno 7 změněných aminokyselin, z nichž dvě výrazně znemožňovaly interakci plášťových proteinů s protilátkami.
Docent Schaffer hodlá v nejbližších měsících vytvořit ještě účinnější generace AAV a také začít s pokusy s lidským sérem.
Vznik AAV odolných proti lidským protilátkám by mohl přinést zvrat v dosud používané genové terapii, jejíž dosavadní výsledky jsou dosti rozporuplné.
Genová terapie je možným východiskem v léčbě takových nemocí jako je dědičná imunitní nedostatečnost, Alzheimerova a Parkinsonova choroba, nebo některé druhy zhoubných nádorů.
Uvedená metoda je v principu použitelná i pro většinu jiných druhů virů a představa, že by ji někdo použil, například na virus pravých neštovic, je úděsná.
David Schaffer se dokonce nechal slyšet, že existují i jiné a jednoduší metody, kterými lze zde popsaného efektu dosáhnout….
- Prameny: University of California Berkeley Journal of Virology Journal of Theoretical Biology 234 (2005) 497–509)
- základní charakteristika AAV
Medicína budoucnosti: biosenzory a umělá inteligence mohou vést k zániku praktického lékařství, jak ho známe
Jiří Kůs ukazuje síťku na hmyz do okna obsahující nanomembránu, která zachycuje i prach, bakterie či toxické látky, propouští ale molekuly kyslíku a vody. Foto: MK
Nové technologie určitě nejsou samospásné a jejich plnému využití ještě stojí v cestě řada překážek (problematice jsme se věnovali zde). Faktem ovšem je, že už nyní přicházejí do praxe a jsou stále častější. V uplynulých dvou letech tak například americká FDA schválila kolem 14 technologií využívajících umělou inteligenci, letos jich už bylo dalších 23. Umělá inteligence tak dnes může být užívána jako podpora klinického rozhodování, ve zobrazovacích metodách, při vývoji nových metod, ze strany pacientů, kteří díky nim získávají více informací o svém zdraví, nebo třeba v epidemiologii, kde využívá analýzu sociálních sítí.
Velkou naději skýtají také genetické metody pro léčbu vzácných onemocnění, kterých dnes známe zhruba přes 7000 a většina z nich je genetického původu. Léčba je ale bohužel k dispozici jen zhruba pro pět procent z nich. V rámci genetické medicíny lze nalézt tři přístupy: genovou terapii, editaci genu a epigenetiku, která znamená modifikaci exprese genu.
Editace genu obnáší přesnou změnu DNA v konkrétním místě, tedy odstranění, modifikování nebo přidání genu.
Jde například o metodu zinkového prstu nebo CRISPR, která umí najít v dědičné informaci požadovaný úsek a Cas9 nukleáza odstřihne zvolené DNA (po modifikaci i RNA).
Technologii je možno využít v diagnostice, kdy je díky přenosným senzorům z moči, krve či buněk možné rychle a přesně zjistit infekci či mutaci způsobující onkologické onemocnění. Grafenové biosenzory přitom dokáží detekovat specifické mutace během pár minut.
Co se týče léčby, známe dnes molekulární základ zhruba 6000 chorob, u nichž by šlo metodu využít (dnes umíme léčit jen necelých 500 z nich). V terapii pak je možné metodu použít in vivo nebo ex vivo, kdy se izolují buňky pacienta, které se upraví a je zároveň možno kontrolovat, co se přesně děje, klonovat a vybírat tak, aby mutace byla správně napravena.
„Je tu ale spousta výzev, které musíme řešit. Jde například o efektivitu nosičů a to, když se CRISPR nepodaří doručit na místo rizika onkologického onemocnění. Pokud používáte vektory, může se také sekvence dostat do jiné části genomu. A potřebujete personalizovanou medicínu, protože tu jsou různé imunitní reakce,“ shrnuje vedoucí Českého centra pro fenogenomiku Radislav Sedláček.
Příkladem vyvíjených terapií budiž léčba HIV, při které narušení proteinu zinkového prstu způsobuje, že se virus nemůže navázat. Díky metodě zinkového prstu se už také částečně povedlo léčit pacienta s Hunterovým syndromem.
Prostřednictvím CRISPERu je pak možné léčit například kongenitální amaurózu (dědičná dětská slepota), kde se v rámci testů povedlo zlepšit zrak u 60 procent pacientů. Dalším příkladem budiž onemocnění krve beta talasémie, kdy se zničí jeden z genů, který problém způsobuje, a zároveň se zapne kopie tohoto genu.
Naději může metoda znamenat také pro pacienty s myelomem, sarkomem nebo melanomem, kde už taktéž běží klinické testy.
K tomu, aby byly tyto metody zaváděny v praxi, ale bude třeba vytvořit vhodné podmínky.
„Potřebujeme personalizovaný přístup, specializované laboratoře a standard pro sekvenování nové generace, protože bude nutné znát sekvence genomů těchto pacientů – budeme muset analyzovat nejen mutaci, ale také dopady terapie.
Musíme mít i nástroje pro editaci genomu a správně zvolit pacienty,“ načrtává Radislav Sedláček. Nově by tak měla vzniknout centra, kde se terapie individuálně připraví, přičemž bude nutno stanovit, jak přesně u daného pacienta mutaci napravit.
Místo kontroly symptomů vyléčení
Co se týče genové terapie, i ta může probíhat buď ex vivo, nebo in vivo. V prvním případě se vezmou buňky z těla, upraví se a pak se vrátí zpět (příkladem budiž léčba srpkovité anémie).
V druhém případě se funkční gen kódující potřebný protein vpravuje prostřednictvím nosiče do těla, kde by měl být gen přepsán a začít produkovat bílkovinu.
K přenosu se používá několik technologií – retroviry, lentiviry a adenoasociované viry (AAV).
„Přemýšlejme o nich jako o vesmírné lodi, která se má připojit k vesmírné stanici. Podle toho, jaký vektor vyberete, má různou kapacitu nést geny a platforma AAV je velice dobrá pro svou balicí kapacitu. Snažíme se přitom dostat DNA do chromozomu, kde se integruje a snaží se o ustavení dlouhodobé exprese genu.
Znamenalo by to, že by stačila jedna léčba a to by bylo vše,“ vysvětluje ředitel globálního medicínského oddělení pro hemofilii, endokrinologii a IEM při divizi vzácných onemocnění Pfizer Ian Winburn, který se velmi soustředí na léčbu hemofilie.
Výzkum Pfizeru v této oblasti se dále zaměřuje také na Duchenneovu svalovou dystrofii, amyotrofickou laterální sklerózu, Friedrichovu ataxii, nemoc Canavanové či Wilsonovu chorobu.
Aby ale snažení bylo úspěšné, musí vědci ještě překonat dvě překážky nastražené imunitou. Při vystavění viru nebo po vakcinaci si totiž tělo vytvoří protilátky, které zneutralizují i virální vektor nesoucí terapii. Proto je nutno znát hladinu pacientových protilátek.
Pokud se vědcům podaří překážky zdolat, mohla by jedna infuze genové terapie u hemofiliků odbourat nutnost pravidelných nitrožilních aplikací srážecího faktoru.
„To pak také pro celou zdravotní péči eliminuje obrovskou zátěž související s péčí o chronicky nemocné. Je to převratné i proto, že naše zdravotnictví nejsou vystavěna na úplné vyléčení, ale spíše na kontrolu symptomů.
Znamenalo by to tedy rozdělení na vyléčení na jedné straně a na straně druhé na kontrolu symptomů,“ načrtává Winburn.
Podle něj je dnes ve výzkumných fázích jedna až tři 362 genových terapií (120 ve fázi jedna, 210 ve fázi dva, 32 ve fázi tři, a aby toho nebylo málo, je vedle toho v jedné ze tří fází vývoje 362 geny modifikujících buněčných terapií, 263 buněčných terapií a 42 produktů tkáňového inženýrství), což změní pojetí zdravotních systémů.
Zhruba 40 genových terapií by přitom mělo být k dispozici do roku 2023. „Je to pro nás hozená rukavice. Jaké základní aktivity k tomu potřebujeme? Samozřejmě odpovídající politiku a strategii, musíme být také schopni hodnotit. Uvědomme si, že jde o jednorázovou léčbu versus dlouhodobé chronické léčení.
Jakým způsobem se pak terapie zaplatí, jednorázově, nebo ve splátkách? To jsou otázky, které si musíme začít klást,“ přibližuje Ian Winburn.
Místo zdlouhavých laboratorních vyšetření rychlé biosenzory
Velký rozvoji zaznamenávají také nové materiály a nanotechnologie. Využívat je lze například k dopravě léčiv, kdy je možné hejno nanobotů podobných kapslím nebo trubičkám navigovat do cíle pomocí magnetismu, světla nebo třeba chemicky. Prvního nanobota pro boj s rakovinou už přitom vědci představili v roce 2017.
„Hitem v cílené dopravě léků a v boji proti nemocem pomocí nanotechnologií je také nanozlato nebo nanodiamanty. Látky se v nanovelikosti chovají zcela jinak než v makropodobě.
Existují koncepty, kdy dopravíte nanozlato do tkáně zasažené rakovinou, pak se infračerveným zářením ohřeje a dojde tak ke spálení tkáně, kterou chcete zničit,“ popisuje předseda Asociace nanotechnologického průmyslu ČR Jiří Kůs.
V současnosti už také běží řada výzkumů a klinických zkoušek výroby náhradních tkání.
V Česku jde například o výrobu náhradní pokožky, pracuje se také na různých konceptech 3D tisku z biologických materiálů.
Do budoucna by dokonce nanotechnologie mohly vylepšovat lidské tělo – jako příklad uveďme studii, kdy bylo pomocí nanočástic dopravených do oka laboratorní myši rozšířeno spektrum jejího zraku.
Vedle léčby lze očekávat široké využití nanotechnologií také v diagnostice.
Ta je založena na malém senzoru na náramku, náplasti nebo i v e-tetování, který z malého množství tělní tekutiny, jako je pot, zjistí údaje, na které se dnes čeká po odběrech krve v rámci laboratorních vyšetření.
Nejde přitom o hudbu budoucnosti – biosenzory na náplastech, které umí nahradit laboratorní testy, už loni vyvinuli odborníci z univerzity v Ohiu. Vyvíjejí se také přenosné testery DNA.
„V mých osobních vizích již nevidím praktického lékaře, jen technologii, kde je propojená senzorika s umělou inteligencí – a pak na konci vidím specialistu.
Čeká nás velmi pravděpodobně zánik systému zdravotnictví a praktického lékaře, jak ho dnes známe,“ načrtává Kůs, podle kterého vývoj spěje k personalizované medicíně. Místo několika léků bychom tak dostávali přesné množství léčiva, které by účinkovalo skutečně jen tam, kde je potřebné.
„Laboratoř přejde z laboratoří s lidmi v bílých pláštích do mobilních zařízení nebo nositelné elektroniky,“ dodává Jiří Kůs.
„Budeme muset změnit přístup k technologiím. Velká část toho, co dělají lékaři, je rutinní práce. Od toho se bude muset trochu upustit, abychom mohli přistoupit k novým přístupům,“ míní Ian Winburn.
Na druhou stranu nehrozí, že by lékaři v budoucnu nebyli potřeba, jejich činnost a zaměření ale zřejmě bude vypadat jinak než dnes.
„Umělá inteligence nikdy nedá přesné ano nebo ne, co se týče diagnózy – vždycky je tam určitá míra nejistoty. Je tedy důležitá odborná, specializovaná znalost.
To bude mít vliv na vzdělávání, takže se různé specializace oproti tomu, co je dnes, budou měnit“ dodává zakladatelka Data Insight Cambridge Sobia Hamidová.
Michaela Koubová
Adeno-associated virus
Species of virus that infects humans mildlyAdeno-associated virusAdeno-associated virus serotype 2 structure from 1LP3. One fivefold axis shown center.Scientific classification(unranked):VirusRealm:MonodnaviriaKingdom:ShotokuviraePhylum:CossaviricotaClass:QuintoviricetesOrder:PiccoviralesFamily:ParvoviridaeSubfamily:ParvovirinaeGenus:DependoparvovirusViruses included:
- Adeno-associated dependoparvovirus A
- Adeno-associated dependoparvovirus B
Adeno-associated viruses (AAV) are small viruses that infect humans and some other primate species. They belong to the genus Dependoparvovirus, which in turn belongs to the family Parvoviridae. They are small (20 nm) replication-defective, nonenveloped viruses.
AAV are not currently known to cause disease. The viruses cause a very mild immune response. Several additional features make AAV an attractive candidate for creating viral vectors for gene therapy,[1] and for the creation of isogenic human disease models.
[2] Gene therapy vectors using AAV can infect both dividing and quiescent cells and persist in an extrachromosomal state without integrating into the genome of the host cell, although in the native virus integration of virally carried genes into the host genome does occur.
[3] Integration can be important for certain applications, but can also have unwanted consequences. Recent human clinical trials using AAV for gene therapy in the retina have shown promise.[4]
History
The adeno-associated virus (AAV), previously thought to be a contaminant in adenovirus preparations, was first identified as a dependoparvovirus in the 1960s in the laboratories of Bob Atchison at Pittsburgh and Wallace Rowe at NIH. Serological studies in humans subsequently indicated that, despite being present in people infected by helper viruses such as adenovirus or herpes virus, AAV itself did not cause any disease.[5]
Use in gene therapy
Advantages and drawbacks
Wild-type AAV has attracted considerable interest from gene therapy researchers due to a number of features. Chief amongst these is the virus's apparent lack of pathogenicity. It can also infect non-dividing cells and has the ability to stably integrate into the host cell genome at a specific site (designated AAVS1) in the human chromosome 19.
[6][7] This feature makes it somewhat more predictable than retroviruses, which present the threat of a random insertion and of mutagenesis, which is sometimes followed by development of a cancer. The AAV genome integrates most frequently into the site mentioned, while random incorporations into the genome take place with a negligible frequency.
Development of AAVs as gene therapy vectors, however, has eliminated this integrative capacity by removal of the rep and cap from the DNA of the vector.
The desired gene together with a promoter to drive transcription of the gene is inserted between the inverted terminal repeats (ITRs) that aid in concatemer formation in the nucleus after the single-stranded vector DNA is converted by host cell DNA polymerase complexes into double-stranded DNA. AAV-based gene therapy vectors form episomal concatemers in the host cell nucleus.
In non-dividing cells, these concatemers remain intact for the life of the host cell. In dividing cells, AAV DNA is lost through cell division, since the episomal DNA is not replicated along with the host cell DNA.[8] Random integration of AAV DNA into the host genome is detectable but occurs at very low frequency.
[8] AAVs also present very low immunogenicity, seemingly restricted to generation of neutralizing antibodies, while they induce no clearly defined cytotoxic response.[9][10][11] This feature, along with the ability to infect quiescent cells present their dominance over adenoviruses as vectors for human gene therapy.
Use of the virus does present some disadvantages. The cloning capacity of the vector is relatively limited and most therapeutic genes require the complete replacement of the virus's 4.8 kilobase genome. Large genes are, therefore, not suitable for use in a standard AAV vector.
Options are currently being explored to overcome the limited coding capacity.[12] The AAV ITRs of two genomes can anneal to form head-to-tail concatemers, almost doubling the capacity of the vector. Insertion of splice sites allows for the removal of the ITRs from the transcript.
Because of AAV's specialized gene therapy advantages, researchers have created an altered version of AAV termed self-complementary adeno-associated virus (scAAV).
Whereas AAV packages a single strand of DNA and must wait for its second strand to be synthesized, scAAV packages two shorter strands that are complementary to each other. By avoiding second-strand synthesis, scAAV can express more quickly, although as a caveat, scAAV can only encode half of the already limited capacity of AAV.
[13] Recent reports suggest that scAAV vectors are more immunogenic than single stranded adenovirus vectors, inducing a stronger activation of cytotoxic T lymphocytes.[14]
Humoral immunity instigated by infection with the wild type is thought to be common.
The associated neutralising activity limits the usefulness of the most commonly used serotype AAV2 in certain applications.
Accordingly, the majority of clinical trials under way involve delivery of AAV2 into the brain, a relatively immunologically privileged organ. In the brain, AAV2 is strongly neuron-specific.
Clinical trials
To date, AAV vectors have been used in over 250 clinical trials worldwide, approximately 8.3% of virus-vectored gene-therapy trials.
[15] Recently, promising results have been obtained from Phase 1 and Phase 2 trials for a number of diseases, including Leber's congenital amaurosis,[4][16][17] hemophilia,[18] congestive heart failure,[19] spinal muscular atrophy,[20] lipoprotein lipase deficiency[21], and Parkinson's disease.[22]
| Indication | Gene | Route of administration | Phase | Subject number | Status |
| Cystic fibrosis | CFTR | Lung, via aerosol | I | 12 | Complete |
| CFTR | Lung, via aerosol | II | 38 | Complete | |
| CFTR | Lung, via aerosol | II | 100 | Complete | |
| Hemophilia B | FIX | Intramuscular | I | 9 | Complete |
| FIX | Hepatic artery | I | 6 | Ended | |
| Arthritis | TNFR:Fc | Intraarticular | I | 1 | Ongoing |
| Hereditary emphysema | AAT | Intramuscular | I | 12 | Ongoing |
| Leber's congenital amaurosis | RPE65 | Subretinal | I–II | Multiple | Several ongoing and complete |
| Age-related macular degeneration | sFlt-1 | Subretinal | I–II | 24 | Ongoing |
| Duchenne muscular dystrophy | SGCA | Intramuscular | I | 10 | Ongoing |
| Parkinson's disease | GAD65, GAD67 | Intracranial | I | 12 | Complete[24] |
| Canavan disease | AAC | Intracranial | I | 21 | Ongoing |
| Batten disease | CLN2 | Intracranial | I | 10 | Ongoing |
| Alzheimer's disease | NGF | Intracranial | I | 6 | Ongoing |
| Spinal muscular atrophy | SMN1 | Intravenous and Intrathecal | I–III | 15 | Several ongoing and complete |
| Congestive heart failure | SERCA2a | Intra-coronary | IIb | 250 | Ongoing |
Structure
Two adenovirus particles surrounded by numerous, smaller adeno-associated viruses (negative-staining electron microscopy, magnification approximately 200,000×)
Genome, transcriptome and proteome
The AAV genome is built of single-stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA), either positive- or negative-sensed, which is about 4.7 kilobase long.
The genome comprises ITRs at both ends of the DNA strand, and two open reading frames (ORFs): rep and cap.
The former is composed of four overlapping genes encoding Rep proteins required for the AAV life cycle, and the latter contains overlapping nucleotide sequences of capsid proteins: VP1, VP2 and VP3, which interact to form a capsid with icosahedral symmetry.[25]
ITR sequences
The inverted terminal repeat (ITR) sequences comprise 145 bases each. They were named so because of their symmetry, which was shown to be required for efficient multiplication of the AAV genome.
[26] The feature of these sequences that gives them this property is their ability to form a hairpin, which contributes to so-called self-priming that allows primase-independent synthesis of the second DNA strand.
The ITRs were also shown to be required for both integration of the AAV DNA into the host cell genome (19th chromosome in humans) and rescue from it,[27][28] as well as for efficient encapsidation of the AAV DNA combined with generation of a fully assembled, deoxyribonuclease-resistant AAV particles.[29]
With regard to gene therapy, ITRs seem to be the only sequences required in cis next to the therapeutic gene: structural (cap) and packaging (rep) proteins can be delivered in trans. With this assumption many methods were established for efficient production of recombinant AAV (rAAV) vectors containing a reporter or therapeutic gene.
However, it was also published that the ITRs are not the only elements required in cis for the effective replication and encapsidation. A few research groups have identified a sequence designated cis-acting Rep-dependent element (CARE) inside the coding sequence of the rep gene.
CARE was shown to augment the replication and encapsidation when present in cis.[30][31][32][33]
rep gene and Rep proteins
On the ‚left side‘ of the genome there are two promoters called p5 and p19, from which two overlapping messenger ribonucleic acids (mRNAs) of different length can be produced. Each of these contains an intron which can be either spliced out or not.
Given these possibilities, four various mRNAs, and consequently four various Rep proteins with overlapping sequence can be synthesized. Their names depict their sizes in kilodaltons (kDa): Rep78, Rep68, Rep52 and Rep40.
[34] Rep78 and 68 can specifically bind the hairpin formed by the ITR in the self-priming act and cleave at a specific region, designated terminal resolution site, within the hairpin. They were also shown to be necessary for the AAVS1-specific integration of the AAV genome.
All four Rep proteins were shown to bind ATP and to possess helicase activity. It was also shown that they upregulate the transcription from the p40 promoter (mentioned below), but downregulate both p5 and p19 promoters.[28][34][35][36][37][38]
cap gene and VP proteins
The right side of a positive-sensed AAV genome encodes overlapping sequences of three capsid proteins, VP1, VP2 and VP3, which start from one promoter, designated p40. The molecular weights of these proteins are 87, 72 and 62 kiloDaltons, respectively.
[39] The AAV capsid is composed of a mixture of VP1, VP2, and VP3 totaling 60 monomers arranged in icosahedral symmetry in a ratio of 1:1:10, with an estimated size of 3.9 MegaDaltons.[40]The crystal structure of the VP3 protein was determined by Xie, Bue, et al.
[41]
AAV2 capsid, shown as a ribbon diagram, with the back half hidden for clarity. One fivefold symmetry axis is shown center.
The cap gene produces an additional, non-structural protein called the Assembly-Activating Protein (AAP). This protein is produced from ORF2 and is essential for the capsid-assembly process.[42] The exact function of this protein in the assembly process and its structure have not been solved to date.
All three VPs are translated from one mRNA. After this mRNA is synthesized, it can be spliced in two different manners: either a longer or shorter intron can be excised resulting in the formation of two pools of mRNAs: a 2.3 kb- and a 2.6 kb-long mRNA pool.
Usually, especially in the presence of adenovirus, the longer intron is preferred, so the 2.3-kb-long mRNA represents the so-called ‚major splice‘. In this form the first AUG codon, from which the synthesis of VP1 protein starts, is cut out, resulting in a reduced overall level of VP1 protein synthesis.
The first AUG codon that remains in the major splice is the initiation codon for VP3 protein. However, upstream of that codon in the same open reading frame lies an ACG sequence (encoding threonine) which is surrounded by an optimal Kozak context.
This contributes to a low level of synthesis of VP2 protein, which is actually VP3 protein with additional N terminal residues, as is VP1.[43][44][45][46]
Since the bigger intron is preferred to be spliced out, and since in the major splice the ACG codon is a much weaker translation initiation signal, the ratio at which the AAV structural proteins are synthesized in vivo is about 1:1:20, which is the same as in the mature virus particle.
[47] The unique fragment at the N terminus of VP1 protein was shown to possess the phospholipase A2 (PLA2) activity, which is probably required for the releasing of AAV particles from late endosomes.[48] Muralidhar et al. reported that VP2 and VP3 are crucial for correct virion assembly.
[45] More recently, however, Warrington et al. showed VP2 to be unnecessary for the complete virus particle formation and an efficient infectivity, and also presented that VP2 can tolerate large insertions in its N terminus, while VP1 can not, probably because of the PLA2 domain presence.
[49]
Classification, serotypes, receptors and native tropism
Two species of AAV were recognised by the International Committee on Taxonomy of Viruses in 2013: adeno-associated dependoparvovirus A (formerly AAV-1, -2, -3 and -4) and adeno-associated dependoparvovirus B (formerly AAV-5).[50][51]